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«Enzymnachweis in Fruchtsäften Wissenschaftliche Abschlussarbeit zur Erlangung des akademischen Grades Master of Science (M.Sc.) in Zusammenarbeit ...»

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Hochschule Neubrandenburg

Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften

Masterstudiengang Lebensmitteltechnologie und Bioprodukttechnologie

Enzymnachweis in Fruchtsäften

Wissenschaftliche Abschlussarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades

Master of Science (M.Sc.)

in Zusammenarbeit mit der Gesellschaft für Lebensmittel-Forschung mbH

unter der Betreuung von

Dr. rer. nat. Nadine Fischbach

Prof. Dr. Peter Meurer

von Juliane Walter

Dezember 2013

urn:nbn:de:gbv:519-thesis2013-0145-2 Danksagung __________________________________________________________________

Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde auf Anregung von Herrn Mikko Hofsommer und Frau Dr. rer. nat. Nadine Fischbach bei der Gesellschaft für LebensmittelForschung mbH in Berlin durchgeführt. Ich möchte mich bei der GfL und insbesondere bei Mikko Hofsommer für das Ermöglichen meiner Abschlussarbeit im Masterstudium bedanken.

Mein besonderer Dank gilt … Dr. Nadine Fischbach, die meine Arbeit und mich betreut hat. Ich bedanke mich bei ihr für die Bereitstellung der interessanten Thematik und die freundliche und wissenschaftliche Unterstützung. Außerdem möchte ich ihr für die immer neuen wegweisenden und konstruktiven Vorschläge sowie für die stets entgegengebrachte Geduld danken. Die Einführung in die wissenschaftliche Gerätepraxis, die fachlichen Erläuterungen zur Aufgabenstellung sowie zu Excel und Word haben mir sehr geholfen.

… Prof. Dr. Peter Meurer für die wertvollen Hilfestellungen im Studium.

… Silke Sommer, Antje Steinweg und Josef Roblero für das überaus angenehme Arbeitsklima und die ständige Hilfsbereitschaft bei laborspezifischen sowie privaten Angelegenheiten.

… Peggy Zelmer-Mayer für ihre Freundlichkeit und die stets vorhandene Bereitschaft bei anstehenden Fragen zu helfen.

… der Gesellschaft für Lebensmittel-Forschung und ihren Mitarbeitern, die mir stets Ansprechpartner waren, mein Projekt durch ihre Ideen und ihre Anregungen bereicherten.

… meinen lieben Eltern sowie meiner Familie, die zu jeder Zeit an mich geglaubt und mich mit unendlicher Geduld und Fürsorge unterstützt haben.

… meinem Freund, der immer für mich da war, mir Mut zugesprochen und mich in meiner Arbeit bestärkt hat.

Abstract __________________________________________________________________

Abstract Pectin is one of the major cell wall components und probably the most complex macromolecule in nature. In food that naturally contain pectin, e.g. fruit, important quality changes during storage and processing are related to changes in pectin structure. Native or added pectic enzymes can play an important role in these changes.

In the present work the changes in activity of the pectic enzymes pectinmethyl esterase, endo-polygalacturonase and pectin lyase in self-squeezed orange juices and orange fresh juices was investigated during cold storage. The activities were determined with three different detection methods. The activity of pectinmethyl esterase was stable during cold storage. The determination of the endo-polygalacturonase could not be performed due to the lack of a capillary viscosimeter. Pectin lyase could not be detected in both types of juices.

In addition, the activity of pectinmethyl esterase in mixtures of self-squeezed orange juice and pasteurized orange juice was tested to evaluate a possible consumer deception by such mixtures. The activity in the mixtures decreased compared to the original self-squeezed orange juice. A deception of the consumer is still possible.

Furthermore, a suitable method for determination of galacturonic acid oligomers using high-performance anion-exchange chromatography is developed. With this method, enzyme treatment in fruit juices should be detected.

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1 Einleitung Fruchtsäfte sind von Natur aus wertvolle Lebensmittel, die aus ernährungsphysiologischer Sicht zu einer gesunden und ausgewogenen Ernährung gehören. Nach der deutschen Gesellschaft für Ernährung (DGE) werden sie deshalb nicht als Getränke, sondern in die wichtige Kategorie der pflanzlichen Lebensmittel eingeordnet. Seit Anfang der Neunziger Jahre liegt der ProKopf-Verbrauch an Fruchtsäften und –nektaren bei bis zu 40 l im Jahr [1].

Nach dem Apfelsaft ist der Orangensaft der zweitbeliebteste Saft in Deutschland [1]. Für den Verzehr stehen Orangendirektsäfte und Orangensäfte aus Konzentrat in den Regalen der Supermärkte bereit. Doch seit einigen Jahren besteht der Wunsch des Konsumenten darin, einen Saft zu erhalten, wie ihn die Natur bietet [2]. Das Produkt soll nach den Vorstellungen der Verbraucher keine Veränderungen bei der Herstellung und Lagerung erfahren [2].

Die Fruchtsaftindustrie brachte ein Erzeugnis mit dem Namen „Orangenfrischsaft“ auf den Markt und verkauft diesen als frische Ware aus dem Kühlregal. Gekühlt wird er deshalb, weil der Saft keinerlei Wärmebehandlung unterzogen wird und bei der Lagerung bei Raumtemperatur schnell verderben würde.

Im Hinblick auf das Wort „Frischsaft“ ist es schwierig, das Produkt eindeutig und sachgerecht zu definieren [2]. In der Fruchtsaftverordnung (FrSaftErfrischGetrV) wird eine Definition für den Begriff „Frischsaft“ nicht aufgeführt.

Diese Bezeichnung wirft jedoch einige Fragen auf, zum Beispiel was der Konsument unter einem Frischsaft versteht oder was „frisch“ bedeutet. Gilt ein Saft nur als frisch, wenn er erst vor kurzer Zeit gewonnen und nicht thermisch behandelt wurde? Und ab wann ist ein Saft nicht mehr frisch? Im Wesentlichen erwarten viele Verbraucher ein nur kurze Zeit vor dem Verzehr hergestelltes Produkt, wobei aber keine klare Vorstellung bezüglich der vergangenen Zeitspanne zu bestehen scheint [2]. Der Knackpunkt liegt wohl eher in der Erwartung, dass der Saft nicht pasteurisiert, nicht konzentriert





1 Einleitung__________________________________________________________________

wurde und auch sonst keine Zusätze erhalten hat. Die Wärmebehandlung ist für viele Konsumenten ein qualitätsmindernder Eingriff, der sensorische Veränderungen des Saftes zur Folge hat. Jedoch ist „pasteurisieren“ nicht das Gegenteil von „frisch“ [2]. Sondern die Qualität und Frische eines Saftes sind abhängig von der Beschaffenheit der eingesetzten Rohware und dem technischen Standard der angewandten Technologie der Verarbeitung [2]. Der Unterschied vom Frischsaft zu einem pasteurisierten Orangensaft liegt also nur im Vorhandensein der natürlichen mikrobiellen Flora und in den Veränderungen des Saftes durch die Aktivität aller in der Frucht vorkommenden Enzyme.

Schon lange wird in der Lebensmittelindustrie die besondere Wirkung von Enzymen genutzt. Sie führen eine Reifung oder eine Verbesserung von Geschmack, Geruch und Konsistenz in Lebensmitteln herbei [34]. Enzyme verhelfen zu einer besseren Sensorik und vereinfachen dazu viele Herstellungsprozesse von Produkten. Zum Beispiel werden Enzyme zur Gewinnung von Käsebruch oder zur Klärung von Wein eingesetzt [34].

Der Einsatz von pektinabbauenden Enzymen zur Verarbeitung von Früchten zu Fruchtsaft ist teilweise unerlässlich. Früchte werden in einer Mühle zu Maische vermahlen. Ohne eine geeignete Behandlung der Maische kann nur ein schwach gefärbter Saft gewonnen werden. Die Farbe des Saftes hat zum Beispiel bei der Entsaftung von rotem Beerenobst eine große Bedeutung.

Niemand möchte einen nur schwach rosa gefärbten Johannisbeersaft trinken.

Die Lösung des Problems liegt in der Erhitzung der Maische auf 20 – 45 °C [7]. Die Zellwände werden durch die Wärmebehandlung für die Farbstoffe durchlässig [3]. Dadurch ist ein direkter Übergang der Farbstoffe in den Saft möglich [3]. Mit der Farbfreisetzung kommt es jedoch gleichzeitig zu einer Umwandlung von wasserunlöslichem Protopektin zu wasserlöslichem Pektin [3]. Die Entsaftung von Früchten ist dann ohne den Einsatz von Enzymen ein

1 Einleitung__________________________________________________________________

eher ineffizientes Verfahren. Der Fruchtsaft wird vom Pektin gebunden, sodass die Maische geliert und sich nicht mehr entsaften lässt.

Die Gelierkraft hängt vom Pektingehalt der Früchte ab, jedoch führt bereits eine geringe Konzentration von Pektin zu Gelbildung [3]. Aus diesem Grund muss eine Behandlung der Maische mit pektinabbauenden Enzymen durchgeführt werden. Durch den enzymatischen Abbau des Pektins geht dessen Wasserbindungsvermögen verloren [3]. Daraus resultiert eine Fest-FlüssigTrennung, die kurze Presszeiten und hohe Saftausbeuten ermöglicht [3]. Da Fruchtmaischen erhitzt werden und sehr sauer sind, ist die Zusammensetzung der Präparate so optimiert, dass sie bei niedrigen pH-Werten, zwischen pH 3 und 4, und bei Temperaturen von 20 - 45 °C ausreichend stabil sind. Das Pektin wird je nach Enzym zu Galacturonsäure, Methanol und Neutralzuckern abgebaut. Diese Abbauprodukte lassen sich mit Hilfe von analytischen Untersuchungsverfahren nachweisen und damit auch die Enzymierung der Fruchtmaische [36]. Eine herausragende Rolle spielt dabei die Galacturonsäure, die einer der Grundbausteine des Pektins ist [4]. Bestimmte Enzyme bauen das Pektin zu Galacturonsäure-Monomeren ab [5]. Mit chromatographischen Analysen lässt sich der Gehalt dieser Monomere einfach und schnell bestimmen [3]. Je höher der Gehalt der Galacturonsäure ist, desto stärker wurde eine Enzymierung der Maische bei der Fruchtsaftherstellung vorgenommen [3]. Die Verwendung von pektinabbauenden Enzymen ist zwar erlaubt und die Enzymierung der Maischen kein qualitätsmindernder Eingriff, aber die Fruchtsafthersteller geben dennoch ungern zu, dass sie Enzyme für eine größere Saftausbeute verwenden. Die Enzymindustrie bietet für dieses „Problemfeld“ Spezialenzyme an, die die Bildung von GalacturonsäureMonomeren unterdrücken. Mit anderen Worten bauen diese Enzyme Pektinbruchstücke ab, die aus mehreren Galacturonsäure-Einheiten bestehen. Diese größeren Bruchstücke werden als Di-, Tri- und Oligomere der Galacturonsäure bezeichnet. Der Nachweis dieser Bruchstücke stellt für bestehende Analyseverfahren eine größere Herausforderung dar.

2 Aufgaben- und Problemstellung __________________________________________________________________

2 Aufgaben- und Problemstellung Der Unterschied zwischen einem Orangenfrischsaft und einem pasteurisierten Orangensaft liegt in der Aktivität der Enzyme, die in der Frucht vorkommen. Den größten Einfluss auf den Saft haben dabei die pektolytischen Enzyme. Ohne eine thermische Inaktivierung verursacht die EndoPolygalacturonase den Abbau von noch vorhandenem Pektin im Orangensaft und damit eine Phasentrennung der Flüssigkeit [7]. Das Enzym Pektinmethylesterase spaltet die Esterbindungen zwischen der Galacturonsäure und dem Methylrest und setzt dadurch Methanol im Orangensaft frei [8]. Pektinlyase ist kein von Pflanzen synthetisiertes Enzym [10]. Durch die intakte mikrobielle Flora im Frischsaft kann dieses Enzym jedoch durch möglicherweise vorhandene Schimmelpilze gebildet werden. Pektinlyase spaltet, wie der Name schon sagt, Pektin und kann ebenfalls für eine Phasentrennung des Saftes verantwortlich sein [10]. Hinsichtlich dieser drei Enzyme sollen Frischsäfte aus dem Handel und selbst gepresster Orangensaft untersucht werden.

Das wichtigste Enzym ist bei diesen Untersuchungen die Pektinmethylesterase. Sie kann als Leitenzym bei der Inaktivierung von Enzymen während der Pasteurisation von Fruchtsäften angesehen werden, da sie ubiquitär vorhanden und ihre Aktivität einwandfrei messbar ist [8]. Unter diesem Aspekt sollen Veränderungen der Aktivitäten dieser drei Enzyme während der Kühllagerung von Frischsäften und selbst gepressten Säften untersucht werden.

Außerdem soll die Aktivität der Pektinmethylesterase in Mischungen aus selbst gepresstem und pasteurisiertem Saft geprüft werden und so eine Täuschung des Verbrauchers durch solche Mischungen möglich ist.

Mittlerweile existieren Enzympräparate auf dem Markt, die das Pektin in Di-, Tri- und Oligomere der Galacturonsäure abbauen und somit eine Enzymierung nicht mehr offensichtlich anzeigen. Deshalb ist der Nachweis einer En

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