WWW.BOOK.DISLIB.INFO
FREE ELECTRONIC LIBRARY - Books, dissertations, abstract
 
<< HOME
CONTACTS



Pages:   || 2 | 3 | 4 |

«DISSERTATION Molecular genetic and cytogenetic analyses of autosomal recessive primary microcephaly (MCPH): Mouse model, new locus and novel ...»

-- [ Page 1 ] --

Aus dem Institut für Medizinische Genetik und Humangenetik

der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Molecular genetic and cytogenetic analyses of

autosomal recessive primary microcephaly (MCPH):

Mouse model, new locus and novel mutations

zur Erlangung des akademischen Grades

Doctor of Philosophy in Medical Neurosciences

(PhD in Medical Neurosciences)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin Mahdi Ghani-Kakhki aus dem IRAN

Gutachter:

1) Prof. Dr. K. Sperling

2) Prof. Dr. med. E. Schröck

3) Prof. Dr. med. E. Schwinger Datum der Promotion: 01.02.2013 Table of Contents Zusammenfassung

Abstract

Introduction

Aims of the PhD thesis

Hypotheses

Methods

Establishment of the Mcph1 mouse model

Genetic mapping for Autosomal Recessive Primary Microcephaly (MCPH)

Mutation screening of MCPH genes

Chromosome condensation assay of MCPH1 patients’ cells

Results

Characterization of the Gene Trap in the ES Cell Line RR0608

Phenotypic Description of the Mice

Analyses of Chromosome Condensation

New locus for Autosomal Recessive Primary Microcephaly (MCPH)

Characterization of mutations in the MCPH genes

Microcephalin missense mutation p.Trp75Arg

ASPM mutations p.Arg3096X, p.Arg1019X and p.Lys1862Gln

Discussion

References

Abstracts

Statement of Authorship

Declaration

Acknowledgement

Zusammenfassung Bei der autosomal rezessiven primären Mikrozephalie (MCPH) handelt es sich um eine fetale Entwicklungsstörung des Gehirns, die sich bereits zum Zeitpunkt der Geburt als Mikrozephalie manifestiert. Die bisher bekannten Gene sind in die Kontrolle des Centrosoms involviert.

Mutationen in dem MCPH1 Gen des Menschen, das für das Protein Mikrozephalin kodiert, führen zu primärer Mikrozephalie in Verbindung mit einem singulären zellulären Phänotyp: der vorzeitigen Chromosomenkondensation (engl. premature chromosome condensation, PCC).

Mikrozephalin weist zwei hoch konservierte BRCT Domänen auf und spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Zellzyklus, der Chromosomenkondensation und der DNA Reparatur. Im Rahmen dieser Promotion wurde das erste Mausmodell mit einem Defekt im Mcph1 Gen generiert, das mit einer fehlerhaften Chromosomenkondensation einhergeht. Zudem wurde ein neuer MCPH Lokus auf Chromosom 10q11.23-21.3 kartiert sowie eine funktionell bemerkenswerte missense Mutation im MCPH1 Gen, p.Trp75Arg, beschrieben, die die sich negativ auf die BRCT Domäne auswirkt. Ferner wurden drei Mutationen in dem MCPH5 (ASPM) Gen identifiziert, p.Arg3096X, p.Arg1019X und die erste missense Variante p.Lys1862Gln. Insgesamt haben die Ergebnisse weitere Belege für die grundlegende Rolle der MCPH Gene für die Gehirnentwicklung geliefert.

-4Abstract Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a neurodevelopment disorder, arising from a failure in embryonic neurogenesis, leading to microcephaly at birth. All known genes implicated in this disorder are involved in the monitoring of centrosome integrity. Mutations in the human gene MCPH1, encoding microcephalin protein, cause primary microcephaly associated with a unique cellular phenotype with premature chromosome condensation (PCC).

Microcephalin contains highly conserved BRCT domains and has fundamental roles in cell cycle, chromosome condensation and DNA repair. The PhD project included generation of the first mouse model of impaired microcephalin function displaying the cellular phenotype of misregulated chromosome condensation, mapping a candidate MCPH locus on chromosome 10q11.23-21.3, reporting on a functionally notable MCPH1 missense mutation, p.Trp75Arg, with destabilizing effect on BRCT domain and identification of three mutations in the ASPM gene for MCPH disorder type five: p.Arg3096X, p.Arg1019X and the first reported missense variant p.Lys1862Gln. These results together provide further biological evidence for the MCPH proteins essential roles in brain development.

-5Introduction Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a rare and genetically heterogeneous disease due to impaired embryonic neurogenesis. Clinically, MCPH is defined by an OccipitoFrontal Circumference (OFC) -3 SD at birth, a reduced brain volume, mental retardation and no further neurological findings except mild seizures [1, 2]. MCPH displays genetic heterogeneity with eight loci mapped to date [3-11]. The birth prevalence of the MCPH has been estimated to be 1.3 to 150 per 100,000 live-births, depending on the population and on the applied SD threshold to define the microcephaly. The eight respective loci and genes identified for this disorder include: MCPH1 (MIM ID #607117) encoding microcephalin [12], MCPH2 (MIM ID #604317 ) encoding WDR62 [13], MCPH3 (MIM ID #604804) encoding CDK5RAP2 [14], MCPH4 (MIM ID #604321) encoding CEP152 [15], MCPH5 (MIM ID #605481) encoding ASPM [16], MCPH6 (MIM ID #609279) encoding CENPJ [14], MCPH7 (MIM ID #181590) encoding STIL [6] and the recently identified gene CEP63 encoding the centrosomal protein 63 [11]. Mutations in the ASPM and WDR62 have been suggested to be the most common causes of this disorder [17]. Further genetic heterogeneity likely exists as about 20–30% of MCPH families were shown to have no linkage to any of the known loci [18]. In fact, all eight known gene products are surprisingly localized to the centrosome suggesting that a common centrosomal mechanism is responsible for controlling the neuron number in the





developing human brain [6, 14, 15, 19-21]. Human MCPH1 gene is located on chromosome 8:

6,264,113-6,501,144 encoding microcephalin protein (UniProt ID Q8NEM0) that has three BRCT domains; one N-terminal BRCT domain at 1 – 93 AA and two C-terminal BRCT domains at 640 – 730 AA and at 751 – 833 AA. The hallmark of mutations in microcephalin is a unique cellular phenotype with a high proportion of cells with prophase-like chromosomes due to premature chromosome condensation in the early G2 phase of the cell cycle and delayed decondensation in the G1 phase. A model system with misregulated chromosome condensation will be useful to obtain further insights into the molecular mechanisms shaping the mitotic chromosomes.

Aims of the PhD thesis

1. Characterization of the cellular phenotype of the microcephalin deficiency in man and in mouse.

2. Identification of new locus for the MCPH disorder.

3. Identification of novel mutations within the known MCPH genes.

–  –  –

Methods Establishment of the Mcph1 mouse model The model was generated using a mouse embryonic stem (ES) cell line from the BayGenomics (RR0608) containing a gene trap in intron 12 of the Mcph1 gene (GeneID 244329) deleting the C-terminal BRCT-domain of the protein. Gene trap insertion site was identified with long range PCR (Roche) and gel electrophoresis. ES cells microinjections and mouse breeding were performed in the Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin. Quantitative PCR reactions were carried out using the POWER SYBR GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems) and Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System according to the manufacturer’s recommendations. Relative quantification was performed by the ∆∆Ct method.

DNA extraction from the mouse tail tips was done with chloroform or with PEQLAB lysis buffer. Mice genotypes were identified by PCR and gel electrophoresis. Forward and reverse primers flanking the trap integration site were applied for detection of the wild type allele. A reverse primer specific for the trap vector and a forward primer from the 5’-integration site were used to identify the trapped allele. Fibroblast cultures were established from the mouse tail tips or peritoneum using 0.5% Trypsin/EDTA and 10% collagenase/DMEM and maintained in DMEM supplemented with 15% fetal calf serum. Chromosome preparations and PLC assays were performed for the fibroblast cultures using the standard procedures. Cell cycle progression was studied with autoradiography by 3[H]-Thymidine pulse labelling (1 µCi/ml). Chromosome decondensation was assessed with treatment of the fibroblast cultures with Cytochalasin B. Mice Brain MRI images were acquired using a 7 Tesla Bruker rodent scanner in the Charité Hospital Berlin. PCR, sequencing, immunofluorescence, western blot and X-gal staining experiments were performed following the standard protocols [22].

-7Genetic mapping for Autosomal Recessive Primary Microcephaly (MCPH) Linkage to any of the known MCPH loci was first excluded using the STR markers. Touchdown PCRs were carried out to amplify the markers with 5'FAM labelled forward primers. Fragment analysis was performed with ROX 400 size standard marker on ABI 3100 DNA analyzer (Applied Biosystems) using the GeneScan/GeneMapper software. Genotyping was performed with the Human Mapping 10K Array (Affymetrix at RZPD, Berlin). For the homozygosity mapping, data was first converted into the appropriate format using Alohomora and Mega2 software. Parametric linkage analysis was performed with Merlin program for a rare recessive model. Haplotypes in the region of interest were estimated by Simwalk2 and visualized by HaploPainter. PCR sequencing was performed following the lab instructions [23].

Mutation screening of MCPH genes

For mutation detection, all 14 exons and exon–intron boundaries of the MCPH1 gene (NM_024596) were PCR amplified. PCR products were sequenced and analyzed on ABI 3730 DNA analyzer using the Sequencing Analysis Software (Applied Biosystems). Sequence variant nomenclature was checked with the Mutalyzer program. Functional effects were predicted with MutationTaster, Polyphen and SIFT programs. Alignment of BRCT domains was assessed with ClustalW [24]. Lymphoblastoid cell lines (LCLs) were established from the mutation carrier cells as previously described (Neitzel 1986) [25]. Sequencing reactions were also performed for the entire coding regions of the ASPM gene (NM_018136/10434bp) using the Big Dye Terminator Ready Reaction Mix (V3.1 from Applied Biosystems). Thermocycler setting was 25 cycles of 96°C for 10sec, 50°C for 5sec and 60°C for 4min [26].

Chromosome condensation assay of MCPH1 patients’ cells

Conventional cytogenetic analyses of cultured T-lymphocytes and lymphoblastoid cell lines (LCLs) were performed using standard techniques. 2000 nuclei were counted and the percentage of prophase/prophase-like and metaphase nuclei was calculated among total nuclei.

–  –  –



Pages:   || 2 | 3 | 4 |


Similar works:

«Benson Meditation 1 Benson Meditation Bensons Meditation (auch: relaxation response) ist eine schulmedizinisch anerkannte Entspannungstechnik. Sie wurde um 1970 von dem US-amerikanischen Kardiologen Herbert Benson (Harvard Medical School, Boston) entwickelt, um Stress besser zu bewältigen und das Risiko von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu senken. Es handelt sich um eine einfache, selbst durchführbare Technik bewusster Atmung. Methode Benson beschreibt eine sog. meditative Entspannungsreaktion,...»

«Häufigkeit und Schweregrad von Zahnerosionen bei Rekruten Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Zahnmedizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Aßmann, Tobias aus Marburg/Lahn Gießen 2008 Aus der Poliklinik für Zahnerhaltung und Präventive Zahnheilkunde des Zentrums für Zahn-, Mundund Kieferheilkunde der Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH Standort Gießen Direktor: Prof. Dr. J. Klimek Gutachter: Frau Prof....»

«Lebenswissenschaften im Dialog 8 Freiheit und Ethos des Arztes Herausforderungen durch evidenzbasierte Medizin und Mittelknappheit Bearbeitet von Urban Wiesing, Georg Marckmann 1. Auflage 2009. Taschenbuch. 96 S. Paperback ISBN 978 3 495 48362 6 Format (B x L): 13,9 x 21,4 cm Gewicht: 148 g Weitere Fachgebiete Medizin Human-Medizin, Gesundheitswesen Medizinische Ethik schnell und portofrei erhältlich bei Die Online-Fachbuchhandlung beck-shop.de ist spezialisiert auf Fachbücher, insbesondere...»

«Aus der Universitätsklinik für Anästhesiologie mit Schwerpunkt operative Intensivmedizin Campus Charité Mitte und Campus Virchow Klinikum der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Untersuchung des Einflusses von C1-Esterase-Inhibitor in Kombination mit Faktor XIII auf die funktionelle Kapillardichte und die Leukozytenadhärenz in der intestinalen Mikrozirkulation bei experimenteller Endotoxinämie Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae...»

«Aus dem Medizinischen Zentrum für Radiologie der Philipps-Universität Marburg Geschäftsführender Direktor: Univ.-Prof. Dr. K.J. Klose Klinik für Nuklearmedizin der Philipps-Universität Marburg Direktor: Univ.-Prof. Dr. T. M. Behr Durch interne Emitter verursachte strahleninduzierte Nephropathie: Dosis-Effektbeziehungen, Prophylaxe und Therapie im präklinischen Modell der Radiopeptidtherapie neuroendokriner Tumoren INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten...»

«TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN I. Medizinische Klinik und Poliklinik am Klinikum rechts der Isar (Direktor: Univ.-Prof. Dr. A. Schömig) Die Rolle von Isl1 und Nkx2.5 im transkriptionellen Netzwerk der kardialen Progenitorzelle Alexander Rudolf Peter Goedel Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J. Rummeny Prüfer...»

«TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Medizinische Universitätsklinik für Präventive und Rehabilitative Sportmedizin Untersuchung von myokardialen Verletzungen und ventrikulärer Funktion bei Marathonläufern in Abhängigkeit von genetischen Parametern Anna Lisa Berberich Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. E. J....»

«Aus dem Zentrum für Zahnmedizin Abteilung für Zahnerhaltung und Präventivzahnmedizin Medizinische Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin Dissertation Klinische Nachuntersuchung und quantitative Randanalyse von im Studentenkurs gelegten Kompositfüllungen im Frontzahngebiet. Eine 6-Jahres-Studie. zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae dentariae (Dr. med. dent.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin von Zahnarzt Björn...»

«Aus der Klinik für Neurologie der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Human perceptual decision making in the visual and tactile domain zur Erlangung des akademischen Grades Doctor of Philosophy (PhD) in Medical Neurosciences vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité Universitätsmedizin Berlin von Hermine Wenzlaff aus Berlin Datum der Promotion: 14-Feb-2014 Table of Contents I Table of Contents 1. General Introduction 1.1. Perceptual decision...»

«Urologische Klinik und Poliklinik der Technischen Universität München Klinikum rechts der Isar (Direktor: Univ.-Prof. Dr. J. E. Gschwend) Prognostische und histologische Besonderheiten bei Prostatakarzinompatienten mit Zweitmalignom. Eine retrospektive Untersuchung. Michael Kübler Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Medizin genehmigte Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr....»





 
<<  HOME   |    CONTACTS
2016 www.book.dislib.info - Free e-library - Books, dissertations, abstract

Materials of this site are available for review, all rights belong to their respective owners.
If you do not agree with the fact that your material is placed on this site, please, email us, we will within 1-2 business days delete him.