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«Analyse von Bindungspartnern des Epstein-Barr Virus Nukleären Antigens 2 (EBNA2) mittels Bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BiFC) ...»

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Aus den Instituten für Infektionsmedizin,

Institut für Virologie,

Universitätskliniken, Gebäude 47, 66421 Homburg/Saar

Direktor: Prof. Dr. N. Müller-Lantzsch

Analyse von Bindungspartnern des Epstein-Barr Virus Nukleären

Antigens 2 (EBNA2) mittels Bimolekularer

Fluoreszenzkomplementation (BiFC)

Dissertation zur Erlangung eines Doktors der Medizin

der medizinischen Fakultät

der Universität Des Saarlandes

Vorgelegt von: Arne Grün

Geboren am: 08.09.1976

INHALTSVERZEICHNIS

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Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung

1.1. Deutsch 1

1.2. Englisch 2

2. Einleitung

2.1. Herpesviren 3

2.2. Das Epstein-Barr Virus 4

2.3. Die Epstein-Barr Virus Infektion 4

2.4. EBV-assoziierte Erkrankungen 5

2.5. Das EBV-Genom 6

2.6. Die latenten Kernantigene des EBV 7 2.6.1. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 2 (EBNA2) 8

2.7. Die humanen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNP) 12 2.7.1. Humane nukleäre Ribonukleoproteine der M-Gruppe 12

2.8. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) 14

2.9. Ziele der Arbeit 16

3. Material

3.1. Zelllinien 3.1.1. Epitheliale Zelllinien 17 3.1.2. Bakterienstämme 17

3.2. Kulturmedien 3.2.1. Kulturmedien für Bakterien 17 3.2.2. Kulturmedien für Säugerzellen 18

3.3. Größen- und Molekulargewichtsmarker 3.3.1. DNS-Größenmarker 18 3.3.2. Protein Molekulargewichtsmarker 19

3.4. Allgemeine Puffer 3.4.1. SDS-Probenpuffer (2x Sample Buffer) 19 3.4.2. PBS (für Proteine, mit Mg und Ca) 20 3.4.3. PBS (für Zellen, ohne Mg und Ca) 20 I

INHALTSVERZEICHNIS

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3.4.4. TE-Puffer

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Tabellenverzeichnis Tab. 3.1. Primärantikörper, deren Epitope und die verwendete Verdünnung 21 Tab. 3.2. Sekundärantikörper und deren verwendete Verdünnung 21

–  –  –

1. Zusammenfassung

1.1. Deutsch Das Epstein-Barr Virus gehört zur Familie der humanen Herpesviren. Es ist an der Entstehung gutartiger Infektionserkrankungen als auch an der menschlicher Tumorerkrankungen beteiligt.

Viele Aspekte der EBV-assoziierten Tumorentstehung sind bis heute noch unverstanden. Das EBV ist fähig in infizierten Zellen in ein latentes Stadium überzugehen. Die Zelle entgeht der Zerstörung, das Genom des Virus liegt als Episom im Zellkern der Wirtszelle vor. Während des latenten Stadiums werden nur wenige virale Genprodukte, wie die Epstein-Barr Virus nukleären Antigene (EBNA), exprimiert. Das EBNA2 ist für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz essenziell. In letzter Zeit fanden sich daneben auch zunehmend Hinweise auf seine Teilhabe am Metabolismus von RNS. Dies spiegelt sich in der wachsenden Anzahl RNS-bindender Moleküle unter den Bindungspartnern von EBNA2 wider. Hierzu gehören unter anderen die heterogenen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNP), eine Familie RNS-bindender Proteine, die in allen Stadien der Entstehung reifer RNS mit dieser assoziieren. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnte nach Sichtung einer cDNSBank im Hinblick auf mögliche Interaktionspartner des EBNA2 die Bindung von EBNA2 an hnRNP-M2 im Hefe-Zwei-Hybrid-System gezeigt werden. Der Versuch die Interaktion in Präzipitationsverfahren zu bestätigen, gelang aufgrund der ausgeprägten Klebrigkeit des hnRNP-M2 nicht. Ziel dieser Arbeit ist der erneute Versuch des Nachweises der Interaktion von EBNA2 und hnRNP-M2. Das relativ neue Verfahren der Bimolekularen FluoreszenzKomplementation eröffnet die Möglichkeit, die durch die molekularen Eigenschaften des hnRNP-M2 bedingten Probleme zu umgehen, indem der Nachweis der Bindung in vivo gezeigt wird. In dieser Arbeit ergaben sich Schwierigkeiten mit dem fertigen hnRNP-M2Klon, der in der SDS-Page nicht die erwartete Größe zeigte. Wir gehen davon aus, dass eine unerwartete Proteinfaltung die Tertiärstruktur, und somit die Oberflächeneigenschaften, des Proteins verändert. Die Ursache der Größenabweichung konnte nicht abschließend geklärt werden. Im folgenden Bindungsassay mittels Bimolekularer Fluoreszenz-Komplementation konnte die Interaktion von EBNA2 und hnRNP-M2 nicht nachgewiesen werden.

ZUSAMMENFASSUNG

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1.2. Englisch

Identification of Epstein-Barr virus nuclear antigen 2 (EBNA2) interaction-partners via Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).

The Epstein-Barr virus belongs to the family of human Herpes viruses. Apart from being the cause of benign diseases such as infectious mononucleosis it also plays a crucial role in the genesis of human malignancies. Many aspects of EBV-associated tumorigenesis are not yet fully understood. EBV is able to enter a latent stage in which the viral DNA is kept in episomal form in the nucleus of the host cell. During latency only a small number of viral proteins such as the Epstein-Barr nuclear antigens (EBNA) are being expressed. EBNA2 is essential for initiation and maintenance of viral transformation of B-cells, activates expression of viral and cellular genes but appears to also be involved in the metabolism of RNA. This is being reflected in the growing number of RNA-binding molecules in the group of EBNA2interacting partners such as the heterogenous nuclear ribonucleoproteins (hnRNP), a family of RNA-binding proteins associated with RNA in all stages of its production.





After screening a cDNA bank for putative EBNA2 binding partners, we were able to show a possible interaction between EBNA2 and hnRNP-M2 via Yeast-Two-Hybrid Screen.

Attempts at confirming the interaction in co-immunoprecipitation-assays failed. The goal of this work was the renewed attempt to demonstrate the interaction between EBNA2 and hnRNP-M2. Novel bimolecular fluorescence-complementation (BiFC) assay offered a way of bypassing the obstacles caused by the molecular characteristics of hnRNP-M2 by showing the interaction in vivo.

Although correct length and orientation of the DNA-construct was confirmed in various assays, Western-blotting of the hnRNP-M2 construct did not produce the expected results as the apparent molecular mass was lower than expected. We suspect occurrence of a posttranscriptional modification altering the surface-characteristics of the construct. In the following Bimolecular Fluorescence Complementation assay we were not able to detect any fluorescence excluding an interaction of the EBNA2- and hnRNP-M2- protein-constructs.

EINLEITUNG

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2.1. Herpesviren Es existieren mehr als 100 verschiedene Herpesviren, die sich alle in Partikelmorphologie und grundlegenden Eigenschaften gleichen (s. Abb. 2.1). Die acht humanen Herpesviren haben einen charakteristischen Organotropismus. Betroffen sind im Einzelnen die Haut (HSV1, 2; VZV), das lymphatische System (EBV; HHV6, 7) und das ZNS (HHV6b). Die Cytomegalovirusinfektion tritt generalisiert auf. Das HHV8 findet man in Lymphozyten und Zellen des Karposi-Sarkoms (CHANG, 1994).

Abbildung 2.1. Schematischer Aufbau der Herpesviren am Beispiel des HSV (MODROW, FALKE, TRUYEN, 2003). In die äußere Lipid-Hüllmembran sind verschiedene Glykoproteine eingelagert. Die Hüllmembran enthält das vom Tegument umgebene Kapsid, in dem sich die spulenartig um das Core-Protein gewickelte Doppelstrang-DNS befindet. Das Tegument enthält wichtige Proteine für die Replikation. Die reifen Viruspartikel sind 120-220 nm groß.

EINLEITUNG

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Die Einteilung in die drei Unterfamilien der α -, β- und γ-Herpesviren erfolgte in Bezug auf Pathogenität, Zielzellen und die Vermehrungseigenschaften in vitro (α: HSV, VZV; β: CMV, HHV6 und 7; γ: EBV, HHV8).

2.2. Das Epstein-Barr Virus (EBV) Der englische Arzt Dennis Burkitt beschrieb in den Fünfziger Jahren des letzten Jahrhunderts erstmals klinische und epidemiologische Eigenschaften eines bei Kindern in Ost- und Zentralafrika endemischen Lymphoms (BURKITT, 1958). Aufgrund der auffälligen Verteilung der Erkrankung in Malaria- und Gelbfiebergebieten, vermutete er die Beteiligung eines infektiösen Agens an der Entstehung des Tumors. Wenige Jahre später gelang Tony Epstein, Yvonne Barr und Bud Achong der elektronenmikroskopische Nachweis eines herepesähnlichen Virus in in vitro-kultivierten Burkitt-Lymphomzellen (EPSTEIN, 1964).

1968 stellten Gertrude und Werner Henle den Zusammenhang zur infektiösen Mononukleose her und benannten das Virus nach seinen Entdeckern Epstein-Barr Virus (HENLE, 1968).

2.3. Die Epstein-Barr Virus Infektion

Der einzig bekannte Wirt des EBV ist der Mensch. EBV ist ubiquitär verbreitet, 95% der europäischen Erwachsenen sind seropositiv. Die Übertragung erfolgt horizontal über den Speichel auf CD21+ Zellen im Mund- und Rachenraum. Bei diesen Zellen handelt es sich vorwiegend um B-Lymphozyten in den Schleimhäuten. Der gp220/350-Komplex des EBV bindet an CD21, den Rezeptor der Komplementkomponente C3d. Es kommt zur polyklonalen B-Zell-Aktivierung mit massiver Immunantwort und der typischen generalisierten Lymphgewebshyperplasie. Im größten Teil der EBV-infizierten B-Zellen stellt sich das Latenzstadium ein. In Abhängigkeit der Expressionsmuster von EBNA1, EBNA2, LMP1 und LMP2, kann heute zwischen 3 Latenztypen unterschieden werden (KUBOTA, 2008).

EINLEITUNG

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2.4. EBV-assoziierte Erkrankungen Die Infektiöse Mononukleose (IM) stellt die mit Frühjahrs- und Herbstgipfel auftretende, gutartige, selbstlimitierende Primärinfektion mit dem Epstein-Barr Virus dar (NIEDERMANN, 1968). Bei der typischen IM kommt es nach einer Inkubationszeit von 8-50 Tagen zu hohem Fieber, generalisierter Lymphgewebshyperplasie, einer Pharyngolaryngitis sowie einer diphterieähnlichen Tonsillitis (SCHAFFNER, RUEF, 1999). Die typischen lymphoproliferativen Blutbildveränderungen mit einem Überschuss an mononukleären weißen Blutzellen gaben der Krankheit den Namen.

Das zu den Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) zählende hochmaligne Burkitt-Lymphom (BURKITT, 1958) gehört zu den häufigsten kindlichen Krebserkrankungen in Äquatorialafrika, Lateinamerika und Neuguinea. Ursächlich kommt eine, aus einer chromosomalen Translokation resultierende, Dysregulation des Proto-Onkogens c-myc in Frage. Eine hiervon betroffene Zelle wird in einen Zustand permanenter Proliferation versetzt.

Das Nasopharynxkarzinom (NPC, ist ein maligner, nasopharyngeal carcinoma) undifferenzierter Tumor des Nasen-Rachen-Epithels. Obwohl weltweit vorkommend, ist die Inzidenz in Südostasien und China bis zu 100-fach erhöht und stellt hier die häufigste maligne Erkrankung bei Männern zwischen 40-50 Jahren sowie die häufigste maligne Erkrankung bei Frauen dar. In 100% aller NPC-Biopsien konnte EBV-DNS nachgewiesen werden (ZUR HAUSEN, 1970; HENLE, 1972; NONOYAMA, 1973). Außerdem findet man fast ausschließlich bei Patienten mit Nasopharynxkarzinom einen hohen IgA-Antikörpertiter gegen die frühen und späten Virusproteine, was auf eine deutliche Korrelation der Infektion zur Tumorigenese deutet. Bestimmte EBNA2- und LMP1-Subtypen scheinen außerdem die Empfänglichkeit für NPC zu erhöhen (TIWAWECH, 2008).

Diskutiert wir die Teilhabe von EBV an der Entstehung des Hodgkin-Lymphoms (HODGKIN, 1973; KEEGAN, 2005) und der Multiplen Sklerose (CHRISTENSEN, 2006). In industrialisierten Ländern fand man in 50% der Fälle von Hodgkin-Lymphomen, in Entwicklungsländern sogar in bis zu 90% der Fälle EBV-DNS in den Tumorzellen. Das Risiko an einem HL zu erkranken, steigt nach IM um den Faktor 2-3. Neben ChlamydiaBakterien, wird auch EBV als mitauslösendes Agens der Multiplen Sklerose diskutiert (GALE, MARTYN, 1995). Die genauen Mechanismen, die die Antikörperbildung auslösen, sind allerdings nicht gesichert und Gegenstand weiterer Forschung.

EINLEITUNG

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2.5. Das EBV-Genom



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