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«Untersuchungen zum Einsatz nanopartikulärer Trägersysteme zur Transfektion von Immun- und Alveolarzellen mit therapeutischen DNAzymen ...»

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Aus dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie

Molekular Diagnostik

des Fachbereichs Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg

Direktor: Prof. Dr. med. H. Renz

Untersuchungen zum Einsatz nanopartikulärer

Trägersysteme zur Transfektion von Immun- und

Alveolarzellen mit therapeutischen DNAzymen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Humanmedizin

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt

von

Christoph Paul

aus Gießen Marburg, 2012 Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am: 24.05.2012 Gedruckt mit der Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. M. Rothmund Referent: PD Dr. H. Garn Korreferent: Prof. Dr. F. Czubayko Inhaltsverzeichnis 1   Einleitung

  1.1   Asthma bronchiale

  1.2   Die Pathogenese des allergischen Asthma bronchiale

  1.3   Antisense-Strategien

  1.3.1   Antisense-Oligonukleotide

  1.3.2   RNA-Interferenz

  1.3.3   Ribozyme

  1.3.4   DNAzyme

  1.4   Die Aufnahme von therapeutischen Oligonukleotiden

  1.5   Surfactant

  1.6   Vektorsysteme

  1.7   Hypothesen und Zielsetzung der Arbeit

  2   Material und Methoden

  2.1   Polyplexe und Lipoplexe

  2.1.1   Berechnung des N/P Verhältnisses

  2.1.2   Messung der Partikelgröße und des Zeta-Potentials

  2.2   Zellkultur

  2.2.1   Zelllinien

  2.2.2   Kultivierung der Zellen

  2.2.3   Zellzählung

  2.3   Durchlflusszytometrische-Analysen

  2.4   Konfokale Mikroskopie

  2.5   Tierexperminentelle Analysen

  2.5.1   Sensibilisierung und lokale Allergenprovokation

  2.5.2   Therapie

  2.5.3   Messung der Lungenfunktion

  2.5.4   Präparation und Probengewinn

  2.5.5   Bronchoalveolären Lavage (BAL)

  3   Ergebnisse

  3.1   Surfactant als Transfektionsmittel in vitro

  3.1.1   Alveofact® führt nicht zu einer verbesserten Aufnahme

  3.1.2   Curosurf® führt nicht zu einer verbesserten Aufnahme

  3.1.3   Die Versuchsergebnisse sind unabhängig vom verwendeten DNAzym.... 44   3.2   PEI und PEI-PEG Polyplexe in vitro

  3.2.1   PEI und PEI-PEG Polymere sind zur Transfektion geeignet

  3.2.2   Die Transfektionseffizienz ist konzentrationsabhängig

  3.2.3   PEG-Seitenketten beeinflussen die Transfektionseffizienz

  3.2.4   Die Transfektionseffizienz ist abhängig vom N/P Verhältnis

  3.2.5   PEI-PEG Polyplexe werden in die Zelle aufgenommen

  3.2.6   Lokalisation von Polyplexen in lysosomalen Strukturen

  3.2.7   Die Polymere bilden kondensierte Komplexe

  3.3   PEI-PEG Polyplexe in vivo

  3.3.1   Atemwegswiderstand

  3.3.2   Veränderungen der Bronchoalveolären Lavage

  4   Diskussion

  4.1   Surfactant und die Aufnahme von DNAzymen

  4.2   PEI-PEG Polymere als Vektorsystem in vitro

  4.2.1   Über den Einfluss von PEG-Seitenketten

  4.2.2   Über den Einfluss unterschiedlicher N/P-Verhältnisse

  4.2.3   Über die Aufnahme von PEI-Polyplexen

  4.2.4   Schlussfolgerungen zur in vitro Transfektion von DNAzymen mit PEI und PEI-PEG

  4.3   PEI-PEG Polymere als Vektorsystem in vivo

  4.4   Schlussfolgerungen

  5   Zusammenfassung

  6   Summary

  7   Abkürzungsverzeichnis

  8   Abbildungsverzeichnis

  9   Quellenverzeichnis

  10   Verzeichnis akademische Lehrer

  11   Danksagung

  1 Einleitung „Asthma ist eine Volkskrankheit mit einer immensen sozialen Auswirkung und steigender Prävalenz in vielen Teilen der Welt.“ (Dietel, 2008)

1.1 Asthma bronchiale Asthma bronchiale ist eine chronische, entzündliche Atemwegserkrankung, die besonders die mittleren und großen Atemwege betrifft. Kennzeichnend für die Erkrankung sind die „Asthmaanfälle“: variablen, intermittierend auftretenden Atemwegsobstruktionen, die ganz oder überwiegend reversibel sind. Während eines Asthmaanfalls führt die Verengung der Atemwege zu einer erschwerten Ausatmung – die Lunge wird überbläht und der Gasaustausch eingeschränkt, was im schlimmsten Fall zum Tod führen kann.

Man unterscheidet zwei wesentliche Varianten des Asthma bronchiales:

Das extrinsische (oder allergische) Asthma, bei dem als Auslöser inhalierte • Antigene angesehen werden und bei dem es sich pathogenetisch um eine Allergie handelt.

Das intrinsische (oder endogene) Asthma, bei dem ein allergischer • Mechanismus nicht nachweisbar ist. Der Pathomechanismus hierbei ist weniger gut erforscht. Eine Auslösung durch infektiöse Agenzien wie z.B. virale Atemwegsinfekte wird diskutiert (Classen et al., 2004).

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der deutlich häufigeren Form des extrinsischen Asthmas.

Asthma Bronchiale ist eine der häufigsten chronischen Krankheiten mit weltweit ca.

300 Millionen Erkrankten (Masoli et al., 2004). Besonders betroffen sind Kinder. In Deutschland ist etwa jedes zehnte Kind und jeder zwanzigste Erwachsene Asthmatiker (RKI, 2006). Weiterhin ist Asthma ein zunehmendes Problem. In der aktuell durchgeführten ISAAC Studie (International Study of Asthma and Allergies in Childhood) zeigte sich, dass die Prävalenz von Asthma bronchiale international betrachtet stark ansteigt (Pearce et al., 2007). Während die Zahl der Erkrankten in Westeuropa und den USA möglicherweise ein Plateau erreich hat, gibt es besonders in den Schwellenländern einen starken Zuwachs (Asher et al., 2006). Neben der Belastung der Betroffenen stellt Asthma auch ein volkswirtschaftliches Problem dar. Jährlich entstehen direkte Kosten von etwa 2,4 Milliarden Euro (Renz et al., 2008). Aufgrund der Häufigkeit des Asthmas, der Schwere und Dauer der Erkrankung sowie der entstehenden Kosten, ist die Therapie und die Suche nach neuen Therapeutika von hohem Interesse.





Asthmatiker werden je nach Stärke ihrer Erkrankung therapiert (Karow, 2010). Die Therapieziele sind die Minderung der Atemwegsobstruktion und die Unterdrückung des Entzündungsprozesses. Häufig wird eine Kombination aus Dauermedikation (Controller) und Bedarfsmedikation (Reliever) gewählt. Zumeist werden beim persistierenden Asthma antiinflammatorische Kortikosteroide und bronchodilative β2Sympathomimetika eingesetzt. Diese können ergänzt werden durch retardiertes Theophyllin, Montelukast und systemische Glukokortikoide (Buhl et al., 2006). Neuere und spezifischere Ansätze der Therapie sind IgE bindende Antikörper wie Omalizumab, Interleukin-4 bindende Rezeptoranaloga, die Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und die spezifische Immuntherapie. Trotz aller Forschungsanstrengungen existiert zur Zeit noch keine effektive kausale Therapie, so dass weiterhin Bedarf nach effektiven, spezifischen und nebenwirkungsarmen Therapeutika besteht.

1.2 Die Pathogenese des allergischen Asthma bronchiale Grundlage des allergischen Asthma bronchiale ist die angeborene oder erworbene Veranlagung des bronchialen Atemwegssystems auf bestimmte inhalative Noxen mit einer quantitativ und qualititativ inadäquaten Entzündung zu reagieren (Classen et al., 2004). Man geht dabei von einer multifaktoriellen Genese aus, da sowohl korrelierende Umweltreize als auch korrelierende genetische Faktoren identifiziert werden konnten.

Genetisch zeigt Asthma bronchiale eine Korrelation mit einer Prädisposition, die als Atopie bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um die Veranlagung, auf Allergene mit der Produktion von IgE-Antikörpern zu reagieren (Holgate, 1997). In der Metaanalyse von genetischen Assoziationsstudien konnten jeweils in 10 oder mehr Studien eine Korrelation von atopischen Patienten mit Veränderungen der Gene für Interleukin-4 (IL-4), dem IL-4 Rezeptor und IL-13 gezeigt werden (Contopoulos-Ioannidis et al., 2007). Umweltreize können beim Asthma bronchiale sowohl protektive als auch schädliche Einflüsse haben. So geht man davon aus, dass eine intrauterine oder kindliche mikrobielle Stimulation des Immunsystems, wie in der Hygiene-Hypothese beschrieben, einen protektiven Einfluss auf atopische Erkrankungen wie das allergische Asthma bronchiale hat (Strachan, 2000). Luftverschmutzung u.a. durch Stickstoff, Dioxid, Ozon und Staub scheint hingegen ein wichtiger Faktor für die Entstehung des Asthmas bronchiale zu sein, wobei diese sowohl durch fossile Brennstoffe als auch Zigaretten entsteht (D'Amato, 2000; Mantzouranis, 2008). Virale Infektionen können sowohl protektive als auch Asthma induzierende Einflüsse darstellen (Lemanske, 2004).

Hinsichtlich der pathophysiologischen Mechanismen des allergischen Asthma bronchiales lassen sich zwei Phasen unterscheiden: Eine Sensibilisierungsphase, in der die immunologische Grundlage für die Entzündungsreaktion gelegt wird, und eine Entzündungsphase, in der die Pathomechanismen zum Tragen kommen. Die Entzündungsphase kann noch einmal in eine Sofortreaktion und eine chronische Reaktion unterschieden werden (Valenta, 2002) (siehe Abbildung 1).

In der Sensibilisierungsphase werden inhalierte Allergene über die Mukosa aufgenommen und von gewebsständigen Antigen-Präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel von Dendritischen Zellen (DC) und Makrophagen, phagozytiert. Dort werden die Allergene prozessiert und über MHC-II Moleküle präsentiert (Racioppi et al., 1993). Nach ihrer Aktivierung migrieren die APCs in die drainierenden Lymphknoten (Lambrecht et al., 2001), wo das an ihren MHC-II präsentierte Antigen von naiven CD4 positiven T-Helferzellen (TH0-Zellen) über den Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor (T-Cell receptor, TCR) erkannt wird (Davis et al., 1998). Nach positiver Interaktion von MHC-II und TCR differenziert sich die TH0-Zelle. Zu welcher Form sie sich differenziert ist dabei abhängig von Antigen, dessen Konzentration und

dem vorherrschendem Zytokinmilieu:

Bei hohen Antigen-Dosen und unter dem Einfluss der Zytokine Interleukin-12 • (IL-12) und IL-18 erfolgt eine Differenzierung zu TH1-Zellen (Hsieh et al., 1993).

Bei niedrigen Antigen-Dosen und unter dem Einfluss von IL-4 erfolgt eine • Differenzierung zu TH2-Zellen (Schmitt et al., 1990).

Abbildung 1: Molekulare Mechanismen des Asthma bronchiale (Valenta, 2002)

a) Schematische Darstellung der Sensibilisierung: Der Kontakt von löslichem Antigen mit der Mukosa der Atemwege kann zur Aufnahme dieses Antigens durch APCs oder Antigen spezifischen B-Zellen führen. Falls dabei eine TH2-Antwort induziert wird, werden Zytokine wie IL-4 und IL-13 produziert, die einen Immunglobulin-Klassen Wechsel zu IgE unterstützen (Sensibilisierung). Die Sensibilisierung führt zur Ausbildung von IgE-B-Gedächnisszellen und allergen-spezifischen T-Gedächnisszellen. Wiederholter Allergenkontakt steigert die Anzahl an B- und T-Gedächnisszellen und erhöht die Menge der produzierten IgE Antikörper, die an Mastzellen, B-Zellen, Makrophagen und Dendritischen Zellen über den FcεRI und FcεRII-Rezeptor gebunden werden. b) Sofortreaktion: Durch Kreuzvernetzung spezifischer gebundener IgE-Antikörper an der Zellmembran wird bei Mastzellen die Degranulation von Histamin und Leukotrien ausgelöst. c) Spätreaktion: Die Spätreaktion wird bedingt durch die Präsentation des allergischen Antigens an T-Zellen die dadurch aktiviert werden, proliferieren und pro-inflamatorische Zytokine wie zum Beispiel IL-4, IL-5 und IL-13 sezernieren. IL-5 führt dabei zu einer verstärkten Freisetzung von Eosinophilen Granulozyten aus dem Knochenmark, zu einer verlängerten Lebensdauer der Eosinophilen Granulozyten, zur Chemoattraktion der Eosinophilen Granulozyten in das Entzündungsgebiet und zu ihrer Aktivierung.

Die proliferierenden TH2-Zellen führen bei B-Zellen zu einem Immunglobulin (Ig) Isotypenwechsel hin zu IgE. Dieser Mechanismus wird durch die von den TH2-Zellen sezernierten Zytokine IL-4 und IL-13 sowie durch die Interaktion mehrer Oberflächenmoleküle auf B- und T-Zellen (IgM/AG/TCR, CD80/CD28, CD40/CD40 Ligand) induziert (Bacharier et al., 1998). Die produzierten IgE Antikörper können über den hochaffinen IgE-Rezeptor FcεR1 auf Mastzellen und basophilen Granulozyten und über den niedrig affinen IgE Rezeptor FcεR2 (CD23) auf eosinophilen Granulozyten gebunden werden (Gould and Sutton, 2008).



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