WWW.BOOK.DISLIB.INFO
FREE ELECTRONIC LIBRARY - Books, dissertations, abstract
 
<< HOME
CONTACTS



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 22 |

«Mechanismus der schnellen Geninduktion von Egr-1 durch Östrogen am Herzen: Ein Steroidhormon geht neue Wege Inaugural-Dissertation zur Erlangung der ...»

-- [ Page 1 ] --

Aus dem Physiologischen Institut

der Universität Würzburg

Lehrstuhl für Physiologie – Schwerpunkt vegetative Physiologie

Vorstand: Prof. Dr. M. Kuhn

Mechanismus der schnellen Geninduktion von Egr-1

durch Östrogen am Herzen:

Ein Steroidhormon geht neue Wege

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Stephan Müller-Botz

aus Würzburg

Würzburg, im Juni 2010 Referent: Prof. Dr. rer. nat. K. Schuh Institut für Physiologie I der Universität Würzburg Korreferent: Prof. Dr. med. M. Schmidt Medizinische Klinik und Poliklinik I der Universität Würzburg Dekan: Prof. Dr. med. M. Frosch Der Promovend ist Facharzt für Allgemeinchirurgie und Notfallmedizin Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Inhalt sver zeichn is

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG

1.1 Zielsetzung

1.2 Bedeutung von Östrogen im kardiovaskulären System

1.3 Mechanismus der Östrogenwirkung

Der klassische Weg der Genregulation (direkte Genregulation durch Steroidhormone – 1.3.1 direkter genomischer Östrogeneffekt)

1.3.2 Indirekte genomische Östrogenwirkung

1.3.3 Nichtgenomische Östrogenwirkung

1.4 Egr-1 als Zielgen von Östrogen im Herzen

1.5 Zellkulturmodelle vom Herzen

1.6 Gentransfer-Methoden

1.6.1 Nichtvirale Transfektionsmethoden von Kardiomyozyten

1.6.2 Viral gestützte Transfektionsmethoden an Kardiomyozyten

2 FRAGESTELLUNG

3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Verwendete Plasmide

3.1.1 Beschreibung der verwendeten Plasmide

3.1.2 Kompetente Zellen und Transformation

3.1.3 Anzüchtung der Bakterien und Aufreinigung des Plasmids

3.1.4 Quantifizierung und Identifizierung der Plasmide

3.2 Adenovirus

3.2.1 Verwendeter Leervektor

3.2.2 Präparation und Purifikation

3.2.3 Quantifizierung der Adenoviruspräparation

3.3 Zellkulturen

3.3.1 HEK 293

3.3.2 Neonatale Kardiomyozyten

Inhaltsverzeichnis

3.4 Nicht-virale Transfektionen

3.4.1 Calcium-Phosphat

3.4.2 SuperFect

LipofectAMIN PLUS™

3.4.3

Viral unterstützte Transfektion – Komponentensystem

3.6 Nachweismethoden

3.6.1 Luciferase Assay

3.6.2 Beta-Galaktosidase-Färbung

3.6.3 Proteinmessung nach der Bio-rad Methode

3.6.4 Immunfluoreszenz zur Bestimmung der Reinheit der Kardiomyozytenkultur und der Transfektionseffizienz

3.7 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

3.7.1 Gewinnung von nukleären Extrakten

„Annealing“ von Oligonukleotiden

3.7.2 3.7.3 Labeling von Oligonukleotiden

3.7.4 Gelshift

3.8 Western blot

4 RESULTATE

4.1 Vergleich von viralen mit nichtviralen Transfektionssystemen an neonatalen Herzmuskelzellen

4.2 Systemoptimierung des Komponentensystems

4.3 Untersuchung der östrogenvermittelten Geninduktion anhand des Egr-1-Promotors....... 47 4.3.1 Die Egr-1-Expression in Kardiomyozyten ist ein direkter Effekt von Östrogen

4.3.2 Der Egr-1-Promotor wird durch Östrogen 6-fach induziert

4.3.3 Die östrogenabhängige Induktion des Egr-1-Promotors erfolgt nicht über die ERE-, sondern über SRE-Bindungsstellen

Bedeutung der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ für die Regulation von Egr-1-luc durch 4.3.4 Östrogen

4.3.5 Bedeutung der ERE im Vergleich zu den serumresponsiven Elementen (SRE) für die EgrInduktion in Abhängigkeit der Östrogenrezeptoren

4.3.6 Die östrogenabhängige Geninduktion des Egr-1-Promotors erfolgt durch Proteinbindung an serumresponsive Elemente (SRE) unter Beteiligung des Serumfaktors

–  –  –

5.1 Transfektion von neonatalen Kardiomyozyten

5.2 Östrogenvermittelte Geninduktion in Kardiomyozyten

Unterschiedliche Effekte der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ

5.3

5.4 Mechanismus des schnellen, nichtgenomischen Effekts von Östrogen auf Egr-1............. 85

5.5 Ausblick

6 ZUSAMMENFASSUNG

7 LITERATURVERZEICHNIS

8 APPENDIX

8.1 Medien und Lösungen

8.2 Abkürzungen

8.3 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien

8.4 Geräteverzeichnis

9 DANKSAGUNG

10 LEBENSLAUF

–  –  –

1 Einleitung

1.1 Zielsetzung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine geeignete und effektive Methode für die transiente Transfektion von neonatalen Kardiomyozyten mit Plasmiden zu etablieren.

Mit Hilfe dieser Methode sollte im Anschluss in einer Promotorstudie die genregulatorische Wirkung von Östrogen an einem Zielgen von Östrogen im Herzen untersucht werden.

Da eine östrogenabhängige Induktion des frühen Wachstumsgens Egr-1 im Myokard bereits nachgewiesen war, sollte anhand des Egr-1-Promotors die Östrogenwirkung auf Herzmuskelzellen in Abhängigkeit der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ auf zellulärer Ebene analysiert werden.

1.2 Bedeutung von Östrogen im kardiovaskulären System





Der Myokardinfarkt als Folge der koronaren Herzerkrankung (KHK) ist bis heute in den Industrienationen als häufigste Todesursache zu verzeichnen (Rosamond et al.

2008; Lloyd-Jones et al. 2009). Durch eine verbesserte klinische und präklinische Versorgung sowie eine Intensivierung primärer und sekundärer Prävention konnte in den letzten 50 Jahren eine Senkung des Mortalitätsrisikos beobachtet werden (Fox et al. 2004).

Die Inzidenz der KHK ist bei prämenopausalen Frauen deutlich niedriger als bei gleichaltrigen Männern und unabhängig von Lebensstil und Populationszugehörigkeit (Kalin, Zumoff 1990). Mit Eintritt der Menopause und hierbei sinkendem Östrogenspiegel ist allerdings für Frauen ein deutlicher Risikoanstieg mit einer erhöhten Inzidenz an kardiovaskulären Ereignissen festzustellen (Barrett-Connor 1997). Generell tritt eine Manifestation kardiovaskulärer Erkrankungen bei postmenopausalen Frauen im Durchschnitt um ca. 10 Jahre verzögert im Vergleich zu gleichaltrigen Männern auf (Kannel, Wilson 1995).

Einleitung

Eine protektive Wirkung des weiblichen Geschlechtshormons Östrogen auf das Herzkreislaufsystem wurde bereits in den ersten Untersuchungen der FraminghamStudie postuliert, nachdem prämenopausale Frauen eine bessere Prognose bei symptomatischer KHK aufwiesen als gleichaltrige Männer, während zwischen postmenopausalen Frauen und Männern kein signifikanter Unterschied in der Prognose nachweisbar war (Ho et al. 1993). Auch bei einer iatrogenen vorzeitigen Menopause (durch Ovarektomie) bei prämenopausalen Frauen findet sich ein signifikanter Risikoanstieg in Bezug auf symptomatische koronare Herzerkrankung, der sich durch Östrogensubstitution wieder reduzieren lässt (Lobo 2007).

Verschiedene, zumeist pathologische Herzveränderungen wie Herzhypertrophie oder zelluläre Umbauvorgänge nach Myokardinfarkt (kardiales Remodeling) weisen ebenfalls geschlechtsspezifische Unterschiede auf (Dahlberg 1990; Marcus et al.

1994; Gardin et al. 1995).

So tritt bei Frauen insgesamt seltener eine Linksherzhypertrophie auf als bei Männern, während nach Eintritt der Menopause Frauen eine höhere Inzidenz an linksventrikulärer Hypertrophie aufweisen als gleichaltrige Männer (Agabiti-Rosei, Muiesan 2002).

Generell wird bei Vorliegen einer Linksherzhypertrophie der Krankheitsverlauf der koronaren Herzkrankheit dramatisch verschlechtert, das Risiko des plötzlichen Herztodes steigt hierbei um das Sechsfache an (Dunn, Pfeffer 1999). Die postmenopausal erhöhte Inzidenz an Linksherzhypertrophie kann durch eine Hormonersatztherapie (HRT: hormone replacement therapy) mit einem Östrogen enthaltenden Präparat wieder aufgehoben werden (Miya et al. 2002).

Zur Erklärung des kardioprotektiven Effekts von Östrogen existieren verschiedene

Modelle:

Ein großer Forschungsschwerpunkt lag seit den ersten Untersuchungen auf dem positiven Östrogeneffekt auf das kardiovaskuläre System (Mendelsohn, Karas 1999).

So erhöht sich beispielsweise das Atheroskleroserisiko mit Eintritt der Menopause deutlich im Vergleich zu prämenopausalen Frauen und zeigt eine mit zunehmendem zeitlichen Abstand zur Menopause progrediente Ausprägung (Dubey et al. 2005).

Einleitung

Zu den protektiven Östrogenwirkungen zählt die Verbesserung der Lipidparameter im Serum (Erhöhung des HDL – high density lipoprotein und gleichzeitige Verminderung des LDL – low density lipoprotein), was ebenfalls als eigenständiges Therapieregime zur primären und sekundären Prävention bei KHK durch Statine von der American Heart Association (AHA) empfohlen wird (Smith et al. 2001).

Weiterhin weist Östrogen einen schnell eintretenden vasodilatativen Effekt auf, der durch eine direkte Beeinflussung der endothelialen NO-Freisetzung vermittelt wird (Mendelsohn, Karas 1999), womit die bereits in den 1970er Jahren erkannte blutdrucksende Wirkung von Östrogen (Pfeffer et al. 1979) auch auf zellulärer Ebene nachvollziehbar wurde. Darüber hinaus ist eine Beeinflussung vasoaktiver Systeme wie Prostacyclin und Thromboxan (Mück et al. 1993) sowie die Freisetzung von cGMP in Endothelzellen (Mück et al. 1994 a) mit konsekutiver Vasodilatation für Östrogen nachgewiesen (Mück et al. 1994 b).

Anderen Erklärungsansätzen zufolge üben Östrogene eine antiproliferative Wirkung auf glatte Gefäßmuskelzellen aus, denen ein Schlüsselprozess bei der Atherogenese und Entstehung von Plaquerupturen und akuten Koronarverschlüssen (Yang et al.

2009) zukommt, was sowohl durch in-vitro- als auch in-vivo-Untersuchungen nachgewiesen werden konnte (Raines, Ross 1993; Vargas et al. 1993; Suzuki et al.

1996).

In gleicher Weise wird durch Östrogen eine schnellere Erholung von Endothelzellen nach Verletzung durch Ballondilatation bewirkt (Krasinski et al. 1997).

Auch auf zellulärer Ebene lässt sich ein Zusammenhang zwischen koronarer Herzerkrankung und Östrogen nachweisen, da eine verminderte Expression des Östrogenrezeptors ERα mit einer erhöhten Inzidenz an kardiovaskulären Erkrankungen einhergeht (Losordo et al. 1994).

Aktuelle Studien weisen auf eine Assoziation von Polymorphismen des Östrogenrezeptors ERα und Ausprägung der koronaren Herzkrankheit bei Männern und Frauen gleichermaßen hin. Die bei Männern bereits festgestellte Beeinflussung der KHK durch bestimmte ERα-Polymorphismen (Shearman et al. 2006) scheint auch bei Frauen zu bestehen (Alevizaki et al. 2007). Offenbar beeinflusst die Expression bestimmter Haplotypen des Östrogenrezeptors ERα die Ansprechbarkeit auf eine Hormonersatztherapie und könnte die Ursache für ein unterschiedliches kardiovaskuläres Risikoprofil für Frauen sein (Lawlor et al. 2006).

Einleitung

Auf Zellebene lassen sich ebenfalls geschlechtsspezifische unterschiedliche Genregulationsmechanismen bei erhöhter kardialer Nachlast durch Aortenkonstriktion am Mausmodell nachweisen (Witt et al. 2008). So findet sich eine Reduktion kardialer Hypertrophie bei Aortenkonstriktion unter Östrogensubstitution ovarektomierter Mäuse in vivo wie auch auf zellulärer Ebene unter Vermittlung durch 17β-Östradiol (Donaldson et al. 2009).

Eine direkte protektive Wirkung von Östrogen auf das Myokard konnte in vivo und in vitro anhand einer reduzierten Apoptoserate durch Östrogensubstitution bei myokardialer Ischämie gezeigt werden (Pelzer et al. 2000; Patten et al. 2004; Kim et al. 2006; Satoh et al. 2007).

Eine verbesserte Reaktion auf eine definierte Verletzungsschwere ist durch Östrogensubstitution im Mausmodell mit einer erhöhten Überlebensrate korreliert und wird durch die Inhibition einer hyperinflammatorischen Immunantwort erklärt (Kovacs et al. 2004). Ebenso reduziert Östrogen rezeptorvermittelt die vaskuläre Leukozytenakkumulation im Rahmen eines Ischämie-Reperfusionsschadens (Simoncini et al. 2003).

Die nach tierexperimenteller Herztransplantation (mit anhängender Aorta) detektierbare erhöhte vaskuläre Expression des Östrogenrezeptors ERα (im Vergleich zur basalen Expressionsrate) wird ebenfalls als Schutzmechanismus gegen Transplantationsarteriosklerose angesehen (Lou et al. 1998).



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 22 |


Similar works:

«Numerische Untersuchungen zum biomechanischen Verhalten verschiedener orthodontischer Ankerimplantate Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Hohen Medizinischen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Eva Stahl aus Dormagen Angefertigt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Bonn 1. Gutachter: Prof. Dr.rer.nat. Christoph Bourauel 2. Gutachter: PD Dr. med. Burger Tag der Mündlichen Prüfung: 22.10.2008 Aus der Poliklinik für...»

«Thursday, January 26, 8pm Friday, January 27, 7pm (UnderScore Friday concert including comments from the stage) Saturday, January 28, 8pm | THE DEBORAH AND WILLIAM R. ELFERS CONCERT Tuesday, January 31, 8pm Please note that Riccardo Chailly, who was to have conducted the BSO’s concerts this week, has had to cancel his appearances for health-related reasons. We are grateful that Bramwell Tovey was available to conduct Mendelssohn’s Lobgesang in place of Mr. Chailly. Also please note that the...»

«AHRQ Healthcare Horizon Scanning System – Potential High-Impact Interventions Report Priority Area 02: Cancer Prepared for: Agency for Healthcare Research and Quality U.S. Department of Health and Human Services 540 Gaither Road Rockville, MD 20850 www.ahrq.gov Contract No. HHSA290201000006C Prepared by: ECRI Institute 5200 Butler Pike Plymouth Meeting, PA 19462 December 2013 Statement of Funding and Purpose This report incorporates data collected during implementation of the Agency for...»

«TEMPEST/TERA Government Levels of Security Enhanced with TERA® Cabling System It’s no news flash that IT security issues are a hot topic. While security has always been in the back of the IT manager’s mind, the recent flood of information, regulation and product pertaining to network security is fairly new in the private sector. Not so in government and military networks. These critical networks have long put security at the top of the list and this focus has resulted in extremely robust...»

«Aus dem Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Ludwig-Maximilians-Universität München Lehrstuhl: Bakteriologie Vorstand: Professor Dr. med. Dr. rer. nat. Dipl. Chem. Jürgen Heesemann Das Yersinia-Adhäsin YadA, ein oligomerer Autotransporter als Prototyp der Oca-Familie eine molekulare Strukturund Funktionsanalyse Dissertation zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität zu München vorgelegt...»

«PD Dr. med. Karin Jordan Fachärztin für Innere Medizin, Hämatologie und Onkologie, Zusatzbezeichnung Palliativmedizin Tel. 0345-557-2019 (Sekretariat Frau Susanne Hildebrand) Fax 0345 557 2950 E-Mail: karin.jordan@uk-halle.de Funktion  Leitende Oberärztin  Leitung der AG Supportive Therapie  Weiterbildungsermächtigung Palliativmedizin (1/2 Jahr) Klinische Schwerpunkte  Sarkome  Keimzelltumore  ZNS-Lymphome Wissenschaftliche Schwerpunkte  Supportive Therapie mit Fokus...»

«    Bachelorarbeit zum Thema Architektur und Wohlbefinden Betrachtung therapeutischer Umwelten Am Beispiel von Krankenhäusern aus architekturpsychologischer Sicht Gutachter: Prof. Dr. Matthias Morfeld 1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Kraus 2.Kontaktadresse: Matthias Schauber matthiasschauber@gmx.de Altes Dorf 31 39576 Stendal Email: matthiasschauber@gmx.de Mobil: 0175/1262089 Matrikelnr.: 20073327   Die Medizin hat mittlerweile die soziokulturellen und psychosozialen Zusammenhänge mit...»

«AUS DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN DER UNIVERSITÄT REGENSBURG PROF. DR. MED. E.-D. KREUSER FACHGEBIET HÄMATOLOGIE UND INTERNISTISCHE ONKOLOGIE IMPLEMENTIERUNG EINER DEFINIERTEN PARENTERALEN ERNÄHRUNG VON TUMORPATIENTEN UNTER CHEMOUND ANTIKÖRPERTHERAPIE: EINE PROSPEKTIVE BEOBACHTUNGSSTUDIE Inaugural – Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Fakultät für Medizin der Universität Regensburg vorgelegt von Susanne Daum AUS DER FAKULTÄT FÜR MEDIZIN DER UNIVERSITÄT...»

«Aus der Klinik für Neurologie Abteilung für Experimentelle Neurologie der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Untersuchuchungen zum makround mikroglialen Differenzierungspotential muriner Knochenmarkzellen in vitro und in vivo Zur Erlangung des akademischen Grades doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin von Matthias Boentert aus Dorsten Dekane: Prof. Dr. med. Joachim W....»

«Einfluss einer Verbesserung der linksventrikulären systolischen Funktion auf das Auftreten ventrikulärer Herzrhythmusstörungen und klinischer Ereignisse nach primärprophylaktischer ICD-Implantation Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation vorgelegt von Anna Anton aus Roshdestwenka (Kasachstan) Berichter: Herr Professor Dr. med. Karl-Christian Koch Herr...»





 
<<  HOME   |    CONTACTS
2016 www.book.dislib.info - Free e-library - Books, dissertations, abstract

Materials of this site are available for review, all rights belong to their respective owners.
If you do not agree with the fact that your material is placed on this site, please, email us, we will within 1-2 business days delete him.